激光共聚焦顯微鏡（CLSM）以激光作為激發(fā)光源，在傳統(tǒng)熒光顯微成像的基礎(chǔ)上，附加激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過計算機進(jìn)行數(shù)字化圖像采集和處理后，可獲得高分辨率光學(xué)切片。以下是使用激光共聚焦顯微鏡拍攝照片的一些技巧：

一、樣品制備

樣品厚度：待測樣品Z大厚度為12mm，蓋玻片厚度應(yīng)小于0.17mm，滑塊厚度為0.81.2mm。

細(xì)胞培養(yǎng)：固定或活的貼壁細(xì)胞應(yīng)當(dāng)培養(yǎng)在共聚焦專用培養(yǎng)皿或蓋玻片上；懸浮細(xì)胞甩片或滴片后，用蓋玻片封片，封片劑多采用甘油和PBS（pH8.5~9）混合液（甘油：PBS=9：1）。

二、拍攝設(shè)置

鏡頭選擇：為快速、準(zhǔn)確找到標(biāo)本、觀察和成像，一般采用由低到高變更物鏡（10倍→20倍→40倍/60倍）。使用40倍物鏡時，需在鏡頭中央滴加適量蒸餾水；使用60倍物鏡時，需在鏡頭中央滴加適量共聚焦專用鏡油；實驗結(jié)束后滴加乙醚、乙醇混合溶液（乙醚：乙醇=7：3），并用擦鏡紙清理殘留鏡油。

針孔參數(shù)：薄標(biāo)本（活細(xì)胞等）需適當(dāng)增大針孔（Pinhole）參數(shù)，從而有效保護標(biāo)本，提高亮度，得到反差更好的圖像；厚標(biāo)本（厚組織切片等）則需適當(dāng)減小針孔參數(shù)，從而獲得更薄、更準(zhǔn)確、更精細(xì)的圖像。

觀察設(shè)置：使用目鏡觀察熒光成像時，盡可能降低汞燈能量并縮短觀察時間，避免熒光信號的快速猝滅。

圖像拼接：當(dāng)樣品圖像的比例遠(yuǎn)超出顯微鏡的成像范圍，又需要得到一張完整又W美的大尺寸照片時，激光共聚焦顯微鏡的“自動拼接”功能（Scan Large Image）就顯得尤為重要。例如，尼康A(chǔ)1 HD25型激光共聚焦掃描顯微鏡借助“自動拼接”功能可以生成高質(zhì)量的25mm視野圖像，即將多個載物臺位置的成像區(qū)域捕捉后進(jìn)行自動拼接，其掃描區(qū)域幾乎是傳統(tǒng)點掃描器的兩倍，實現(xiàn)從單個圖像中采集更多的空間信息。

三、參數(shù)調(diào)節(jié)

激光強度和檢測器電壓：激光強度和檢測器電壓的增高，都可以相對提升成像亮度。但激光能量過高會對生物樣本產(chǎn)生光毒性，并引起熒光染料發(fā)生光漂白；而檢測器的信號放大有一定限度，當(dāng)電壓值超過一定閾值檢測器噪音大幅度增加（假信號，會導(dǎo)致成像模糊）。因此，激光強度和檢測器電壓調(diào)節(jié)需要相輔相成，在滿足成像速度和分辨率情況下盡可能平衡光損傷、成像亮度和信噪比。

圖片亮度和圖片背景：成像圖片的亮度和背景都是數(shù)字信號的改變，可以增加成像的對比度，但對成像分辨率沒有改變，可根據(jù)實際需求進(jìn)行調(diào)節(jié)。需注意避免過曝，過曝的成像片子存在熒光定量分析不準(zhǔn)的問題。

掃描速度和平均次數(shù)：在保證合適亮度的同時，適當(dāng)增加激光強度，降低檢測器電壓值可以提升圖片信噪比。此外，可通過調(diào)慢掃描速度來提高信噪比，掃描速度越慢，成像質(zhì)量越高。許多共聚焦設(shè)備還配備Average功能，即拍攝多張取平均值，也可以提高信噪比。

掃描分辨率：采樣分辨率的大小直接決定是否能達(dá)到光學(xué)分辨率的極限和Z終成像圖片的清晰度。許多共聚焦設(shè)備在實驗者設(shè)置好所有參數(shù)后，會有一個推薦值匹配系統(tǒng)Z佳分辨率，以達(dá)到設(shè)備認(rèn)為的Z佳成像效果。常規(guī)圖片采集推薦使用系統(tǒng)默認(rèn)的采樣分辨率，也可根據(jù)需求適當(dāng)調(diào)整。

四、光路與拍攝邏輯

光路設(shè)置（合適的檢測器檢測和發(fā)射光譜接受范圍）、拍攝邏輯（順序掃描模式和線切線掃描模式）、掃描模式（共聚焦模式、超分辨率模式、快速超分辨率模式）等都會影響成像效果，應(yīng)根據(jù)實驗?zāi)康暮蜆颖咎攸c進(jìn)行調(diào)節(jié)。

綜上所述，激光共聚焦顯微鏡拍攝照片的技巧涉及樣品制備、拍攝設(shè)置、參數(shù)調(diào)節(jié)以及光路與拍攝邏輯等多個方面。掌握這些技巧有助于提高拍攝效率和成像質(zhì)量。